1 CRISPR-Cas系统的发现

有规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)广泛存在于绝大多数细菌和古细菌中，其转录产生的crRNA(CRISPR-RNA)与反式激活的tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)共同构成引导RNA(guide RNA, gRNA)，gRNA可引导核酸内切酶Cas蛋白(CRISPR associated protein)对噬菌体的基因片段进行切割，构成细菌的CRISPR-Cas免疫防御系统。人们发现可以通过人工合成的gRNA模拟自然的tracrRNA和crRNA结构，与Cas蛋白一起特异性识别和剪切核酸序列，构成新一代的基因编辑技术。2013年，2个团队[1-2]首次使用嗜热链球菌和化脓性链球菌构建Ⅱ型CRISPR-Cas9系统，随后该系统日趋成熟，并被广泛用于哺乳动物细胞的基因组编辑。 2015年，该家族内的另一系统CRISPR-CasC2c2[3](现称Cas13)被成功鉴定，与Cas9不同， Cas13结合和切割的对象为RNA。目前科学家们已经从Leptotrichiabuccalis(Lbu)、Leptotrichiawadei(Lwa)、Leptotrichiashahii(Lsh)以及Lachnospiraceaebacterium(Lba)等多种细菌中解析出了Cas13a结构，根据其来源不同分别称为LbuCas13a[4]、LwaCas13a[5]、LshCas13a[6]和LbaCas13a[7]。

2 CRISPR-Cas系统的分类

目前CRISPR-Cas系统分为2类、6型和30多种亚型[8]。其中1类系统(包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型)具有多个亚单位效应复合物，包括多个Cas蛋白；而2类系统(包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型)中效应物是种类单一、体积较大、多结构域的蛋白分子[9](见中插彩版图1)。研究表明，所有的CRISPR-Cas系统可能来源于同一个祖先，1类系统在进化过程中变为具有单一功能的Cas基因，同时丢失其他的Cas基因从而形成2类系统[10]。CRISPR-Cas13系统属于2类CRISPR系统的Ⅵ型，根据结构还可再细分为a、b、c、d四个亚型。

图1 两类CRISPR-Cas系统的结构差异及主要组成[9]

3 CRISPR-Cas13系统的作用机理

以CRISPR-Cas13a系统为例，高分辨率结构分析[4]显示细菌Leptotrichiabuccalis(Lbu)中解析出的LbuCas13a属于“双瓣叶”球状蛋白质结构，由1个crRNA识别瓣叶(Recognition lobe, REC)和1个核酸酶瓣叶(Nuclease lobe, NUC)组成，其NUC上有2个高等真核生物和原核生物核苷酸结合域(Higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding, HEPN)。

图2 LbuCas13a、crRNA、靶RNA复合物的复合结构[4]A：LbuCas13a的结构域 ； B：crRNA-靶RNA组成的双链RNA结构 ； C：LbuCas13a-crRNA-靶RNA组成整体结构的前后视图

Cas13a效应蛋白在识别靶RNA上的前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)(在Cas13a中称为Protospacer flanking site,PFS)并与其结合的过程中可发生构象变化，HEPN1结构域在靶RNA结合后向HEPN2方向移动，形成一个活化的HEPN催化位点。活化的HEPN催化位点表现出两种核糖核酸酶(Ribonuclease, RNase)活性，一种可将自身的pre-crRNA处理为crRNA，令一种表现为HEPN-RNase活性，对靶RNA或游离RNA进行切割[4]。

图3 Cas13a构象改变和HEPN活化以及表现RNase活性的过程[4]

Cas13a的催化位点位于外表面，所以一旦Cas13a被靶标RNA结合激活，就可以发挥非特异性RNA酶功能，裂解任何可触及的单链RNA(single-stranded RNA, ssRNA)，而不论它们是否与crRNA同源或是否存在PFS，这种效应称为附带切割效应(Collateral effect)。相比之下，Cas9和Cas12只能在其HNH或RuvC两个核酸酶催化位点的引导链(gRNA)上切割靶标双链DNA(double-stranded DNA, dsDNA)[4]。Cas13b同样包含2个HEPN结构域，因此有类似Cas13a的功能，Cas13d在大多数方面表现与先前研究的Cas13类似，而Cas13c相关研究较少[11]。

4 CRISPR-Cas13技术的应用

自2015年C2c2(现称Cas13)系统被发现以来，其研究突飞猛进，并于2017年被《Nature Methods》评为2016年度革新技术[12]。该靶向RNA的核酸编辑技术在多个领域均有所应用。

4.1 RNA示踪 Cas13a蛋白的HEPN 结构域中Arg(精氨酸)和His(组氨酸)突变可形成核酸酶活性缺失的dCas13a(dead Cas13a)，其能够结合目标RNA但不切割，因此成为一个可编程的RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)，利用其与特定RNA序列的结合特性，配合荧光标记技术可对胞内特定RNA片段进行示踪[13]。

4.2 临床诊断 通过设计与目标核酸互补的gRNA，并与Cas13蛋白组装可组成RNA检测报告系统。其报告基因通常一端为荧光基团，另一端是化学猝灭剂，当报告基因与样品中的特异性靶标核酸结合时，Cas酶将对报告基因进行裂解，从猝灭剂中释放荧光基团发出荧光，且信号可量化。利用该技术可对待测基因进行精确测量或定性分析[14]。

图4 应用报告基因reporter进行核酸检测[14]

文章来源：《中华疾病控制杂志》 网址: http://www.zhjbkzzz.cn/qikandaodu/2021/0412/859.html

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